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HPLC（高效液相色谱）分析

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发布时间：2025-03-13 10:46:27 更新时间：2025-03-12 10:46:37

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

HPLC（高效液相色谱）分析需围绕 方法开发、仪器校准、样品处理、分离优化及数据解析 等核心步骤展开，适用于药物、食品、环境及化工产品的定性与定量分析。以下是基于 USP <621>（色谱法通则）、ICH Q2(R1)（分析方法验证） 及 GB/T 16631-2019（液相色谱分析方法通则） 的系统化操作指南：

一、HPLC核心组件与参数优化

组件/参数	功能与优化要点	推荐配置/标准
色谱柱	C18反相柱（5μm, 4.6×250mm）、HILIC亲水柱	根据极性选择（如Waters XBridge® C18）
流动相	乙腈-水/缓冲盐（pH 2~8）、梯度洗脱程序	避免使用磷酸盐（易结晶堵塞）
流速	1.0 mL/min（常规分析）、0.2 mL/min（微径柱）	柱压≤4000 psi（避免超压）
检测器	UV-Vis（190~400nm）、DAD（多波长）、ELSD（蒸发光散射）	Agilent 1260 DAD（波长精度±1nm）
柱温箱	25~40℃（温度稳定性±0.5℃）	高温分析需选耐高温柱（如ZORBAX SB-C18）

二、标准化操作流程

1. 方法开发与验证

目标物特性分析：
- 溶解性（logP）、pKa值（影响离子化）、紫外吸收波长（λmax）。
色谱条件初筛：
- 流动相比例（如乙腈:水=50:50），梯度优化（0~100%乙腈/20min）。
系统适用性测试：
- 理论塔板数（N≥2000）、分离度（Rs≥1.5）、拖尾因子（0.9~1.2）。

2. 样品前处理

固体样品：
1. 粉碎后超声提取（甲醇/乙腈溶剂），0.22μm滤膜过滤。
液体样品：
1. 稀释/浓缩至线性范围，SPE（固相萃取）净化（如C18柱去基质干扰）。

3. 仪器操作步骤

启动与平衡：
- 流动相脱气（超声或在线脱气机），以初始比例平衡色谱柱至基线稳定（约10倍柱体积）。
进样与分析：
- 进样量10~20μL（避免超载），记录保留时间与峰面积。
数据采集与处理：
- 积分参数设置（斜率灵敏度、峰宽阈值），外标法/内标法定量。

三、关键性能验证指标

参数	定义与要求	计算公式/判定标准
保留时间重复性	连续进样RSD≤1%	RSD = (SD/Mean) × 100%
线性范围	R²≥0.999（至少5个浓度点）	最小二乘法拟合，残差分析
检出限（LOD）	S/N≥3	LOD = 3.3 × SD/slope
定量限（LOQ）	S/N≥10	LOQ = 10 × SD/slope
回收率	加标回收率80%~120%	回收率 = (测定值/加标量) × 100%

四、常见问题与解决方案

现象	可能原因	解决措施
峰拖尾	柱效下降或流动相pH不匹配	更换色谱柱，调节流动相pH（±0.5）
基线漂移	流动相比例波动或温度不稳定	使用梯度延迟体积小的混合器，稳定柱温箱
保留时间漂移	柱温波动或流速不稳定	检查泵密封圈，确保柱温箱设定准确
鬼峰（Ghost Peaks）	进样污染或流动相杂质	超纯水冲洗系统，使用HPLC级溶剂

五、典型应用案例

应用领域	分析目标	色谱条件
药物分析	阿司匹林含量测定（USP 40）	C18柱，乙腈-0.1%磷酸（40:60），流速1mL/min，λ=276nm
食品安全	防腐剂（苯甲酸、山梨酸）检测	HILIC柱，乙腈-20mM乙酸铵（85:15），DAD多波长检测
环境监测	多环芳烃（PAHs）定量	C18柱，乙腈-水梯度洗脱，荧光检测器（Ex 260nm/Em 420nm）
代谢组学	氨基酸/有机酸谱分析	亲水相互作用色谱（HILIC），Q-TOF质谱联用

六、维护与故障排除

日常维护：
- 每次使用后以高纯度溶剂冲洗色谱柱（如乙腈:水=80:20）；
- 定期更换泵密封圈（每6个月或压力波动时）。
故障排查工具：
- 压力异常：检查过滤器堵塞、管路气泡或柱头筛板污染；
- 峰形异常：验证样品溶剂与流动相兼容性，避免强溶剂效应。

通过系统化HPLC分析，可精准实现复杂基质中目标物的分离与定量。建议结合 QbD（质量源于设计） 理念优化方法开发流程，并针对痕量分析（如农残、激素）采用 SPE或LLE（液液萃取） 富集技术。对于极性差异大的组分，可探索 UHPLC（超高效液相色谱） 提升分离效率（柱长50~~100mm，粒径1.7~~2μm）。