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微生物限度检测

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发布时间：2025-03-14 10:51:57 更新时间：2025-03-13 10:52:15

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

微生物限度检测用于评估非无菌药品、食品、化妆品及医疗器械中微生物污染水平，确保产品符合 安全性 与 质量可控性 要求。检测需遵循 《中国药典》2020版通则1105-1107、ISO 11737-1（医疗器械）、GB 4789（食品） 及 化妆品安全技术规范（2023版） 等标准。以下是系统化检测方案：

一、检测项目与标准

检测类别	核心指标	适用标准	判定标准（示例）
需氧菌总数	细菌、霉菌、酵母菌总数（CFU/g或CFU/mL）	药典通则1105、ISO 4833-1	口服固体制剂≤10³ CFU/g
控制菌检查	大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等	药典通则1106、GB 15979（卫生用品）	不得检出（10g/mL）
耐热菌（芽孢）	需氧/厌氧芽孢菌计数	ISO 18416（化妆品）、GB 4789.15	食品罐头：阴性（商业无菌）
真菌毒素	黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等	GB 5009.22（食品）、药典通则2351	黄曲霉毒素B₁≤5μg/kg（谷物）

二、检测方法与操作流程

1. 需氧菌总数测定（平皿法）

样品处理：
- 固体样品：无菌研碎→加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液→均质（拍击式均质器）；
- 液体样品：直接稀释（1:10→1:1000梯度）。
接种培养：
- 取1mL供试液→倾注胰酪大豆胨琼脂（TSA）→30~~35℃培养3~~5天；
- 霉菌酵母菌用沙氏葡萄糖琼脂（SDA）→20~~25℃培养5~~7天。
结果计算：菌落总数=平均菌落数×稀释倍数样品量（g或mL）菌落总数=样品量（g或mL）平均菌落数×稀释倍数

2. 控制菌检查（薄膜过滤法）

样品前处理：
- 供试液10mL通过0.45μm滤膜→滤膜转移至选择性培养基（如麦康凯琼脂）。
培养与鉴定：
- 大肠埃希菌：44.5℃培养24h→IMViC试验（吲哚+/甲基红+/VP-）；
- 沙门菌：亚硒酸盐胱氨酸增菌液→XLD琼脂→血清学凝集试验。

3. 快速检测技术

技术	原理	适用场景
ATP生物发光法	微生物ATP与荧光素酶反应发光	生产环境表面微生物实时监测
PCR/qPCR	特异性基因片段扩增（如16S rRNA）	致病菌快速鉴定（2~4小时）
MALDI-TOF MS	微生物蛋白指纹图谱分析	临床分离株快速鉴定（分钟级）

三、关键设备与试剂

设备/试剂	用途	推荐型号/品牌
微生物限度检测仪	集过滤、培养、计数于一体	Milliflex® Quantum（默克）
恒温培养箱	多温度段精准控制（±0.5℃）	Memmert IPP系列
PCR仪	致病菌核酸扩增（快速筛查）	Bio-Rad CFX96 Touch™
选择性培养基	大肠菌群（VRBA）、金黄色葡萄球菌（BP）	北京陆桥、Oxoid

四、常见问题与解决方案

问题现象	可能原因	改进措施
菌落蔓延无法计数	琼脂水分过高或涂布不均	改用倾注法，控制琼脂温度（45~50℃）
假阴性（控制菌）	样品抑菌性未中和	增加稀释度或添加中和剂（如卵磷脂、聚山梨酯）
平皿污染率高	操作环境洁净度不足	在生物安全柜（BSC）中操作，定期验证环境菌
计数结果波动大	样品不均质或稀释误差	规范均质时间（2~5分钟），校准移液器

五、限值标准对比

产品类型	需氧菌总数（CFU/g或mL）	控制菌要求	标准来源
口服固体制剂	≤10³	不得检出大肠埃希菌、沙门菌	中国药典2020版
外用药品	≤10²	不得检出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌	USP <61>
普通化妆品	≤10²~10³	不得检出耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌	化妆品规范2023
婴幼儿食品	≤10⁴	沙门菌/单增李斯特菌不得检出	GB 10765-2021

六、检测报告与认证路径

报告内容：
- 样品信息（批号、规格）、检测方法、菌落计数数据、控制菌鉴定结果、结论；
- 附检测标准（如《中国药典》2020版通则1105）及实验室资质（CMA/CNAS）。
认证要求：
- 药品：GMP认证需定期微生物监控，无菌/非无菌产品分类检测；
- 医疗器械：ISO 11737-1（生物负载测定）+ ISO 11137（灭菌验证）；
- 食品：HACCP体系认证，需提交批次检测报告。