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多糖检测

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发布时间：2025-03-18 15:13:22 更新时间：2025-03-17 15:14:06

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

多糖检测需围绕含量测定、结构表征、分子量分布及生物活性四大核心展开，适用于食品、药品、生物制品等领域。遵循国家标准（《中国药典》2020版）、国际标准（ISO 11292、AOAC 999.03）及行业规范，以下是系统化检测方案：

一、核心检测项目与标准

1. 多糖含量测定

总多糖含量：
- 苯酚-硫酸法：标准曲线法（葡萄糖为对照，波长490nm，GB/T 15672）；
- DNS法（3,5-二硝基水杨酸）：还原糖测定，适用于水解后检测（AOAC 999.03）。
特异性多糖：
- HPLC-ELSD/RID：柱前衍生（PMP）测单糖组成（如葡萄糖、甘露糖比例），C18柱（药典通则0512）；
- 酶联免疫法（ELISA）：针对特定多糖（如β-葡聚糖），灵敏度达ng级。

2. 结构表征

单糖组成分析：
- GC-MS：硅烷化衍生（BSTFA）测中性糖、糖醛酸（ISO 11292）；
- 离子色谱（HPAEC-PAD）：直接测氨基糖、唾液酸（CarboPac PA20柱）。
糖链连接方式：
- 核磁共振（NMR）：¹³C/¹H谱分析糖苷键类型（α/β构型，药典通则0441）；
- 红外光谱（FTIR）：特征峰（如O-H 3400cm⁻¹，C-O 1070cm⁻¹）辅助验证。

3. 分子量分布

凝胶渗透色谱（GPC/SEC）：
- 多角度激光光散射（MALLS）：绝对分子量测定（适用10³~10⁶ Da，ASTM D6474）；
- 示差折光检测（RID）：相对分子量分布（TSK-GEL色谱柱）。

4. 生物活性检测

免疫调节活性：
- 巨噬细胞吞噬实验（中性红法，检测NO/TNF-α分泌）；
- 淋巴细胞增殖试验（MTT法，刺激指数≥1.5为有效）。
抗氧化活性：
- DPPH/ABTS自由基清除率（IC50≤5mg/mL为高活性）；
- FRAP法（铁还原能力，与抗坏血酸对照）。

二、检测方法与设备

含量与结构分析设备：
- 紫外分光光度计（Thermo NanoDrop 2000，苯酚-硫酸法）；
- HPLC-ELSD（Agilent 1260，蒸发光散射检测器，C18色谱柱）。
分子量测定设备：
- GPC-MALLS（Wyatt DAWN HELEOS，ASTM D6474）；
- 超高效聚合物色谱（APC）（Waters ACQUITY APC，快速分析10⁴~10⁷ Da）。
生物活性检测平台：
- 酶标仪（BioTek Synergy H1，MTT/DPPH检测）；
- 流式细胞仪（BD FACS Canto II，免疫细胞活性分析）。

三、质量控制关键点

样品前处理：
- 脱蛋白：Sevage法（氯仿:正丁醇=4:1）或酶解法（胰蛋白酶+胃蛋白酶）；
- 脱色素：活性炭吸附或大孔树脂纯化（AB-8树脂，乙醇梯度洗脱）。
方法验证：
- 线性范围：标准曲线R²≥0.995；
- 加标回收率：80-120%（苯酚-硫酸法，葡萄糖加标）。
数据准确性控制：
- 内标法：甘露醇/木糖醇作为内标（GC-MS分析）；
- 平行实验：至少3次重复，RSD≤5%。

四、常见问题与解决方案

问题	原因分析	解决方案
苯酚-硫酸法显色异常	硫酸浓度不均或显色时间过长	控制反应温度（25℃±2℃），严格计时5min
HPLC峰重叠	单糖衍生不完全或色谱柱效下降	优化衍生条件（70℃×30min），更换色谱柱
分子量分布偏差	柱效降低或流动相离子强度波动	定期校准色谱柱，控制缓冲液pH（6.8±0.1）
生物活性不稳定	多糖提取物含杂质或降解	增加纯化步骤（超滤/透析），低温保存样品

五、标准与认证参考

国内标准：
- 《中国药典》2020版（多糖含量测定，通则0512）；
- GB/T 35818-2018《保健食品中粗多糖的测定》。
国际标准：
- AOAC 999.03（膳食纤维中多糖测定）；
- ISO 11292-2021（速溶咖啡中多糖检测）。

六、应用场景与建议

食品行业：
- 功能性评价：如香菇多糖增强免疫力（需ELISA+细胞实验）；
- 质控指标：饮料中可溶性多糖≥1.0%（苯酚-硫酸法）。
药品研发：
- 结构确证：注射用多糖分子量均一性（GPC-MALLS）；
- 稳定性研究：加速试验（40℃/75%RH×6个月）监测降解。

总结多糖检测需以“精准定量、结构明确、活性可靠”为目标，结合经典方法（苯酚-硫酸法）与高端技术（NMR、GPC-MALLS），并根据应用场景选择检测策略。生产企业应建立从原料提取（脱蛋白/脱色）到成品分析（分子量/活性）的全流程质控体系，并通过药典/ISO方法验证确保合规性。针对高附加值产品（如药用多糖），建议联合细胞实验+动物模型验证功能活性，提升产品竞争力。