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地衣芽孢杆菌检测

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发布时间：2025-03-21 13:46:38 更新时间：2025-03-20 13:47:38

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌，常用于工业酶生产、饲料添加剂、生物防治及医药领域。其检测需围绕菌种鉴定、活菌计数、代谢产物分析、安全性评估四大核心展开。以下是检测的关键方法与技术要点：

形态学鉴定
- 显微镜观察：革兰氏染色（紫色阳性）、芽孢染色（孔雀绿法），菌体呈杆状，芽孢椭圆形、中生或近端生；
- 菌落特征：普通琼脂培养基上菌落圆形、灰白色、边缘不规则（37℃培养24-48小时）。
生化特性分析
- API 50CH系统：检测碳水化合物利用谱（如葡萄糖+/乳糖-）；
- 关键生化反应：
  - VP试验（产乙酰甲基甲醇）：阳性；
  - 硝酸盐还原：阳性；
  - 淀粉水解：阳性（产α-淀粉酶）。
分子生物学鉴定
- 16S rRNA测序：PCR扩增后测序（引物27F/1492R），与NCBI数据库比对（相似度≥99%）；
- 特异性基因检测：
  - gyrB基因：设计引物gyrB-F（5'-GAGTCGTACAAGGTAGCC-3'）/gyrB-R（5'-CAGTTCCAGTACCGTCAT-3'），扩增产物约350bp；
  - 生物膜相关基因（tasA）：用于区分致病性菌株。

传统培养法
- 选择性培养基：
  - TSS培养基（Trypticase Soy Broth + 7% NaCl）：抑制非嗜盐菌，30℃培养24小时；
  - MYP培养基：添加多粘菌素B（抑制杂菌），菌落呈粉红色（产甘露醇）。
- 计数标准：稀释涂布法，结果以CFU/g或CFU/mL表示（GB 4789.2）。
快速定量方法
- 实时荧光定量PCR（qPCR）：
  - 引物针对16S rRNA或gyrB基因，检测限≤10² CFU/mL；
  - 标准曲线法计算拷贝数（R²≥0.99）。
- 流式细胞术：SYBR Green/PI双染法区分活菌/死菌（ISO 19344）。
活菌代谢活性检测
- ATP生物发光法：检测活菌ATP含量（灵敏度≤10³ CFU/mL，ISO 1833）；
- 呼吸链脱氢酶活性：TTC法（无色TTC被还原为红色甲臜）。

酶活性检测
- 淀粉酶：碘液法测定淀粉水解圈直径（GB 20287）；
- 蛋白酶：Folin-酚法测酪蛋白水解产物（酶活单位U/g）。
抗菌物质检测
- 抑菌圈试验：对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制直径≥10mm（琼脂扩散法）；
- 次级代谢产物分析：
  - LC-MS：检测表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）等脂肽类物质；
  - HPLC：定量分析γ-聚谷氨酸（γ-PGA）含量（保留时间8-10分钟，C18柱）。
安全性评价
- 溶血性试验：血琼脂平板培养，无β溶血环（安全性菌株要求）；
- 小鼠急性毒性试验：LD50＞5000mg/kg（饲料添加剂标准，GB 13078）。

应用场景	检测重点	方法标准	限值/要求
饲料添加剂	活菌数、杂菌污染	GB/T 13079	活菌≥1×10¹⁰ CFU/g，沙门氏菌阴性
工业酶制剂	淀粉酶/蛋白酶活性	GB 20287	酶活≥5000 U/g
发酵食品	致病性基因（tasA、hblC）	PCR-凝胶电泳	目标基因阴性
医药生产	内毒素检测	鲎试剂法（GB/T 14233）	≤0.25 EU/mg

样本前处理
- 环境样本（土壤/水）：10倍系列稀释，涡旋振荡5分钟；
- 食品/饲料：无菌均质后过滤（0.45μm滤膜），富集培养。
快速筛查流程
- 初筛：选择性培养基培养+菌落PCR（gyrB基因）；
- 确认：16S rRNA测序+生化试验。
高通量技术应用
- 全基因组测序：分析毒力基因、抗生素抗性基因；
- MALDI-TOF MS：快速鉴定至种水平（数据库需包含地衣芽孢杆菌参考谱）。