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支原体检测

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发布时间：2025-04-21 10:51:12 更新时间：2025-04-20 10:53:47

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

支原体检测的技术要点与临床应用

一、检测的重要性和背景介绍

支原体（Mycoplasma）作为目前已知最小的可自主繁殖微生物，因其缺乏细胞壁的特异性结构，对常规抗生素具有天然耐药性，已成为生物医药、细胞治疗和临床医学领域的重要检测对象。在细胞培养体系中，支原体污染率高达15-35%，可导致细胞代谢异常、基因表达紊乱和实验数据失真；在临床诊疗中，肺炎支原体和泌尿生殖道支原体引发的感染占呼吸道和生殖系统疾病的30%以上。特别是近年来生物制药行业对细胞基质安全性的严苛要求，使得支原体检测成为GMP认证、生物制品放行和临床诊断的必检项目，其检测技术直接关系到药品安全性、科研数据可靠性和疾病诊断准确性。

二、具体检测项目和范围

支原体检测主要覆盖以下领域： 1. 细胞库与细胞治疗产品：包括主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）及终产品的定期筛查 2. 生物制品：疫苗、单克隆抗体、重组蛋白等生物制剂的支原体污染检测 3. 临床诊断：呼吸道分泌物、泌尿生殖道拭子、关节液等样本的病原学检测 4. 动物源性产品：胎牛血清、胰酶等细胞培养试剂的支原体风险评估 5. 洁净环境监测：细胞培养室、生物反应器等关键区域的污染溯源

三、使用的检测仪器和设备

现代支原体检测体系采用多模态技术平台： 1. 实时荧光定量PCR仪：用于核酸扩增检测（如ABI 7500） 2. 荧光显微镜：配备DAPI/Hoechst染色系统（如Nikon ECLIPSE Ni-U） 3. 酶标仪：ELISA检测专用（如BioTek Synergy H1） 4. 微生物培养系统：包含厌氧培养箱（如Thermo Scientific Forma 3110）和专用培养基 5. 超高速离心机：用于样本前处理（如Beckman Coulter Optima XPN-100） 6. 生物安全柜：二级生物安全柜（如ESCO Airstream AC2-4S1）

四、标准检测方法和流程

现行主流检测方法包含四大技术路线： 1. 培养法（金标准）：取样→SP-4培养基接种→37℃厌氧培养21天→菌落形态学观察灵敏度：10⁰-10¹ CCU/mL，特异性＞99% 2. PCR检测法： DNA提取（Magnetic bead法）→引物设计（16S rRNA/gapdh基因）→qPCR扩增（含内参对照）检测限达1-10 copies/μL，检测周期4-6小时 3. ELISA法：包被特异性抗体→样本孵育→酶标二抗显色→OD450值测定适用于大批量筛查，灵敏度≈10³ CFU/mL 4. DNA荧光染色法： Hoechst 33258染色（0.1μg/mL）→荧光显微镜观察（激发波长365nm）可检测贴壁细胞污染，分辨率达10⁴ CFU/mL

五、相关技术标准和规范

检测活动需符合以下技术规范： 1. 国际标准： - EP 2.6.7（欧洲药典）：推荐培养法+指示细胞法联合验证 - USP<63>（美国药典）：要求核酸检测技术验证 2. 国内标准： - 中国药典2020版通则3301：规定细胞基质检测方法 - GB/T 38502-2020：消毒剂抗支原体效力检测 3. 行业指南： - ISO 17025:2017检测实验室认可准则 - CLSI M43-A文件：抗菌药物敏感性试验指南

六、检测结果评判标准

1. 阳性判定： - 培养法：培养基出现典型"荷包蛋"样菌落 - PCR法：扩增曲线Ct值≤35且有熔解峰验证 - 荧光染色：细胞周边出现特异性点状荧光 2. 阴性判定： - 培养法：21天无菌落生长 - PCR法：三次重复检测未见特异性扩增 - ELISA法：OD值＜cut-off值（阴性对照均值×2.1） 3. 可疑结果处理： - 重复检测（更换检测方法验证） - 采用正交试验（如培养法+PCR法联合确认） - 启动污染溯源程序（环境样本平行检测）

需特别注意的是，对于治疗性生物制品，我国NMPA要求必须通过培养法+核酸法的组合检测，且最终产品需经过28天培养验证。临床样本检测需结合血清学检测（如IgM抗体滴度≥1:160），配合分子检测结果进行综合诊断。随着数字PCR和宏基因组测序技术的发展，支原体检测正朝着超高灵敏度（10^-6 CFU/mL）和种属特异性鉴定的方向演进。