| 资源中文名称 | 可诱导型心脏Drd5基因条件性敲除小鼠模型 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 资源英文名称 | Drd5flox/flox, Myh6 CreERT2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 疾病概述 | 慢性心力衰竭（Chronic heart failure, CHF）是由于心脏结构或功能异常导致 心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征, 是多种心脏病终末阶段的临床表现。慢性心衰患者的再 入院死亡率每年约为 20%，五年死亡率接近 50% 。因此，在机体出现心衰之前早期防治应该是治疗研究的重点，阻止心肌损伤和重构，是降低心衰发生发展的关键。 本研究设计基于同源重组理论，利用胚胎干细胞打靶及显微注射技术，构建了Drd5floxp/flox小鼠，利用Cre/LoxP系统Drd5在心肌细胞可诱导性条件敲除小鼠(Drd5flox/flox, Myh6 CreERT2)，在成年后特异性心脏敲除Drd5，得到可稳定遗传、既有明显表型又保持原有生存率的心肌病模型.该小鼠给予他莫昔芬诱导后两周表现为左心室肥厚，6周后射血分数和短轴缩短率持续降低，心腔扩大，室壁变薄，心肌纤维增多，心功能严重受损。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 实验动物背景信息 |
C57BL/6小鼠 |
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| 模型制作方法 |
一、模型设计原理： GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。Drd5-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现Drd5基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。 根据Drd5基因组结构和蛋白功能保守区分析可知：Exon2（aa1-478）为公共外显子，位于蛋白功能保守区上：7tm_GPCRs superfamily domain，条件性删除这个外显子后，将破坏7tm_GPCRs superfamily domain,蛋白失活。因此决定在Exon1的两边定点插入FloxP位点，实现将Exon1条件性敲除。
1）GRNA靶点设计及活性检测
在要删除的Exon1外显子两端，设计gRNA靶点如下
使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（货号：VK007）进行gRNA体外活性检测，结果如下：
gRNA靶点活性检测结果 靶点活性数据分析如下：
根据活性检测结果，我们选用活性最高的L2,R1进行F0代首建鼠构建。 2）PCR结果分析
使用如下引物进行目的条带扩增
M：BM2000 Marker，如右图所示 NC:阴性对照 如图所示，5♂扩出目的条带 3）Drd5floxp/flox小鼠测序结果分析 以M-CKO-M30-5小鼠测序结果为例，测序结果标注如下： 5’端FloxP比对结果： |
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