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一、模型设计原理：
GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。Drd5-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现Drd5基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。
根据Drd5基因组结构和蛋白功能保守区分析可知：Exon2（aa1-478）为公共外显子，位于蛋白功能保守区上：7tm_GPCRs superfamily domain，条件性删除这个外显子后，将破坏7tm_GPCRs superfamily domain,蛋白失活。因此决定在Exon1的两边定点插入FloxP位点，实现将Exon1条件性敲除。
1）GRNA靶点设计及活性检测
在要删除的Exon1外显子两端，设计gRNA靶点如下
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靶点名称 |
靶点序列（标灰为PAM序列） |
活性分析 |
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Drd5-L1 |
GCGCGCTGCCGACAGGATCGG |
10% |
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Drd5-L2 |
TCCCATCCTGGGGACTAGAGG |
60% |
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Drd5-L3 |
GCAGGGTGAGCGCCCCTCGGG |
40% |
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Drd5-L4 |
TGACCGTCCCCAGACCCGAGG |
50% |
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Drd5-R1 |
TGTTCTGTGACTTGCACCTGG |
95% |
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Drd5-R2 |
GAGTGGCAATTGCTGGTATGG |
95% |
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Drd5-R3 |
GCAGCAGCCCGAGAACAGGGG |
85% |
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Drd5-R4 |
TTTCTCCCTGATTTGTTGTGG |
85% |
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Drd5-R5 |
CACTTTCTCGTCTCTAAAGGG |
95% |
使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（货号：VK007）进行gRNA体外活性检测，结果如下：
gRNA靶点活性检测结果
靶点活性数据分析如下：
根据活性检测结果，我们选用活性最高的L2,R1进行F0代首建鼠构建。
2）PCR结果分析
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扩增说明 |
引物名称 |
引物序列（5’-3’） |
PCR产物大小 |
使用如下引物进行目的条带扩增
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两端floxp插入 |
F |
CTGGGCTTGGGGCGAGGGTAT |
KI-floxp：2564 bp |
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测序 |
R |
GAGAAACACTGAGCACCAACTG |
WT：2496 bp |
M-CKO-M30 (1-19,NC)目的带扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：
M：BM2000 Marker，如右图所示
NC:阴性对照
如图所示，5♂扩出目的条带
3）Drd5floxp/flox小鼠测序结果分析
以M-CKO-M30-5小鼠测序结果为例，测序结果标注如下：
5’端FloxP比对结果：
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