SHIV1157ipd3N4静脉途径感染恒河猴模型技术规范
1 范围
本文件规定了采用嵌合猴免疫缺陷病毒（SHIV）1157ipd3N4毒株经静脉途径感染恒河猴（Macaca mulatta）模型的建立、检测、评价与应用的技术要求。
本文件适用于：
2 规范性引用文件
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GB/T 14927.1 实验动物 近交系小鼠、免疫缺陷动物基因标志分析方法
GB/T 35892 实验动物 福利伦理审查指南
中华人民共和国卫生部. 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS 233-2017）
美国国立卫生研究院（NIH）. 艾滋病研究和动物模型操作指南（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
SHIV1157ipd3N4
一种由猴免疫缺陷病毒（SIV）外壳包裹HIV-1基因片段的重组嵌合病毒。该毒株携带HIV-1的tat、rev、vpu和env基因，并使用源自SIVmac239的3'长末端重复序列（LTR），通过体内连续传代获得适应恒河猴的致病性。
3.2
病毒接种物
指经定量检测具有明确病毒RNA拷贝数或半数组织培养感染剂量（TCID50）的SHIV1157ipd3N4病毒原液，用于实验性接种。
3.3
血浆病毒载量
指单位体积血浆中SHIV病毒RNA的拷贝数，是衡量病毒水平的核心指标。
3.4
CD4+ T细胞计数
指单位体积全血中表达CD4分子的T淋巴细胞绝对数，是评估模型免疫损伤程度的关键指标。
4 检测项目及方法
4.1 病毒接种物的制备与质控
采用人外周血单个核细胞（PBMC）或TZM-bl细胞系扩增SHIV1157ipd3N4毒株。扩增完成后，离心去除细胞碎片，通过0.45 μm滤膜过滤分装。质控检测应包括：病毒滴度（TCID50）、RNA拷贝数（定量聚合酶链式反应，qPCR）、无菌检测（需氧菌、厌氧菌、支原体）及内毒素检测。病毒原液应保存于-80℃以下。
4.2 感染状态的纵向监测
4.2.1 血浆病毒RNA定量
采集EDTA抗凝血，分离血浆。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术，针对SHIV保守区域（如gag或pol基因）设计引物和TaqMan探针。通过体外转录制备标准品，构建标准曲线，定量检测血浆中病毒RNA拷贝数。检测下限应达到50拷贝/mL。
4.2.2 淋巴细胞亚群分析
采集全血，采用多色流式细胞术。使用荧光标记的单克隆抗体组合（如CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD45-APC等）标记细胞。裂解红细胞后，通过流式细胞仪获取细胞，分析CD3+CD4+及CD3+CD8+淋巴细胞的百分比及绝对计数。绝对计数采用双平台法或微球计数法。
4.2.3 病毒特异性免疫应答
4.2.3.1 细胞免疫：采用酶联免疫斑点法（ELISpot）检测分泌干扰素-γ（IFN-γ）的T细胞。使用覆盖SHIV Gag、Env蛋白的肽库刺激PBMC，孵育后显色计数斑点形成细胞。也可采用胞内细胞因子染色法结合流式细胞术进行多色分析。
4.2.3.2 体液免疫：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中抗SHIV特异性结合抗体。采用中和抗体检测法（TZM-bl假病毒中和试验）检测血浆样本中和抗体滴度。
4.3 病毒潜伏感染库的检测
4.3.1 细胞相关病毒DNA：提取PBMC或淋巴结单细胞悬液的总DNA，采用Alu-gag定量聚合酶链式反应检测整合到宿主基因组中的病毒DNA。该技术利用Alu序列作为上游引物靶点，病毒gag序列作为下游靶点，扩增整合病毒基因，以区分整合病毒与未整合DNA。
4.3.2 细胞相关病毒RNA：提取PBMC总RNA，采用逆转录定量聚合酶链式反应检测细胞内病毒转录本，反映病毒转录活性。
5 检测仪器及设备
5.1 核酸提取与扩增设备
5.1.1 全自动核酸提取仪：用于从血浆或细胞样本中高效、标准化提取病毒RNA或DNA。
5.1.2 实时荧光定量PCR仪：用于病毒载量定量、整合DNA定量及宿主基因表达分析。
5.1.3 梯度PCR仪：用于引物退火温度的优化及常规基因扩增。
5.2 细胞分析与分选设备
5.2.1 分析型流式细胞仪：配备至少三激光（例如488nm、640nm、405nm）及相应滤光片，用于淋巴细胞亚群绝对计数、免疫激活标志（HLA-DR、CD38）、耗竭标志（PD-1）及胞内细胞因子染色分析。
5.2.2 细胞计数仪：用于PBMC分离后的细胞活率及计数。
5.3 免疫学检测设备
5.3.1 酶联免疫斑点分析仪：用于ELISpot实验的斑点计数，具备标准化参数设定功能。
5.3.2 多功能酶标仪：用于ELISA实验的光密度值读取及数据分析，支持吸光度、化学发光检测模式。
5.4 样本处理与保存设备
5.4.1 二级生物安全柜：用于感染性样本（血液、细胞培养上清）的操作，保护操作者及环境。
5.4.2 高速冷冻离心机：用于血浆分离及PBMC分离过程中的离心操作。
5.4.3 程序降温仪或液氮罐：用于PBMC、淋巴结细胞等珍贵样本的长期冻存。
6 检测标准与结果评价
6.1 感染成功标准
动物接种SHIV1157ipd3N4后2-4周内，血浆病毒载量应达到峰值，通常大于1×10^5拷贝/mL。若连续两次检测（间隔两周）病毒载量均低于检测下限，且未检出病毒特异性抗体，判定为感染失败。
6.2 疾病进展评价
6.2.1 典型进展型：感染后6个月内，CD4+ T细胞计数持续下降，下降幅度超过基线值的50%，病毒载量维持在高水平（>1×10^4拷贝/mL）。
6.2.2 长期不进展型：感染超过6个月，CD4+ T细胞计数稳定在基线值70%以上，病毒载量处于低水平（<1×10^3拷贝/mL）或检测不到。
6.2.3 精英控制者：无需抗病毒治疗，血浆病毒载量持续低于检测下限。
6.3 药物疗效评价标准
6.3.1 病毒学疗效：治疗组血浆病毒载量较基线下降的对数值。完全应答定义为病毒载量低于检测下限；部分应答定义为病毒载量下降>1 log10但未低于检测下限。
6.3.2 免疫学疗效：治疗期间CD4+ T细胞计数的恢复情况，通常定义为较基线或较治疗前最低点的升高值及升高幅度。
6.3.3 停药后反弹时间：指停止治疗后，病毒载量首次恢复到治疗前水平或超过特定阈值（如1×10^3拷贝/mL）的时间。
6.4 参考数据要求
所有检测结果应以原始数据和规范化表格形式呈现。关键指标（病毒载量、CD4计数）需采用重复测量方差分析或混合线性模型进行统计学分析，以比较不同时间点及不同组别间的差异。
