副溶血性弧菌耐热溶血素(TDH)测定检测

副溶血性弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）是一种广泛分布于海水、海底沉积物及鱼贝类等海产品中的革兰氏阴性嗜盐菌，是引发细菌性食物中毒的重要病原体之一。其致病性与多种毒力因子相关，其中耐热直接溶血素（Thermostable Direct Hemolysin, TDH）是最关键的毒力因子和标志性毒素。TDH具有耐热性（100°C加热10分钟仍保留部分活性），能溶解人或兔的红细胞，破坏细胞膜，导致组织损伤和腹泻等症状。因此，准确检测副溶血性弧菌是否产生TDH及其含量，不仅是判断菌株潜在致病性的核心依据，也是评估食品安全风险、追溯食源性疾病暴发源头以及制定有效防控措施的关键环节。

检测项目

本检测的核心项目是：副溶血性弧菌耐热直接溶血素（TDH）的定性或半定量测定。具体包括：

1. 定性检测： 判定被检副溶血性弧菌菌株是否具有产生TDH的能力（通常报告为TDH阳性或阴性）。
2. 半定量检测（溶血效价测定）： 测定TDH溶解特定红细胞（通常是兔或人“O”型红细胞）的能力强度，以溶血单位或最高溶血稀释度表示。
3. 菌株致病性评估： 根据TDH检测结果（特别是“神奈川现象”Kanagawa Phenomenon, KP）判断分离菌株的潜在致病性。绝大多数临床致病株为TDH阳性（KP阳性），而环境分离株多为TDH阴性（KP阴性）。

检测仪器

进行TDH测定主要依赖基础微生物实验室设备和耗材：

1. 恒温培养箱： 用于细菌培养，通常设定在35-37°C。
2. 恒温水浴锅： 用于精确控制溶血试验的反应温度（通常为37°C），以及样品的加热处理（用于证明耐热性）。
3. 离心机： 用于洗涤和制备红细胞悬液。
4. 无菌操作设备： 生物安全柜（BSC）或超净工作台，确保无菌操作。
5. 分光光度计： 用于定量测定溶血后上清液中的血红蛋白释放量（吸光度），进行半定量分析。
6. 微量移液器及枪头： 用于精确移取液体。
7. 培养皿、试管、微孔板： 用于细菌培养、制备菌液和进行溶血试验（试管法或微孔板法）。
8. pH计： 用于精确配置缓冲液。

检测方法

TDH测定的经典和常用方法是神奈川试验（Kanagawa Test），即溶血试验，主要步骤为：

1. 菌株培养与菌液制备： 将纯化的副溶血性弧菌可疑菌落接种于含3% NaCl的心脑浸液肉汤（BHI）或胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，35-37°C培养18-24小时。离心收集上清液（含分泌的TDH）。
2. 红细胞悬液制备： 无菌采集兔或人“O”型抗凝血，用生理盐水或PBS（含3% NaCl以维持渗透压）洗涤红细胞3-4次至上清液澄清。最后将洗涤好的红细胞配制成2%的红细胞悬液（于含3% NaCl的PBS中）。
3. 溶血试验（试管法）：

• 取一系列小试管（如10×75mm）。
• 在试管中加入0.5mL 2%红细胞悬液。
• 加入0.5mL细菌培养上清液（试验管）。同时设置阴性对照（0.5mL无菌肉汤 + 0.5mL红细胞悬液）和阳性对照（已知TDH阳性菌株上清液）。
• 轻轻混匀，置于37°C恒温水浴锅中孵育。
• 孵育时间通常为1-2小时，期间可定时观察（如30分钟、60分钟、120分钟）。完全溶血表现为透明、鲜红色上清液（血红蛋白释放），管底无红细胞沉淀；部分溶血为混浊红色上清液；不溶血则红细胞完全沉淀，上清液澄清无色。

4. 耐热性验证（可选）： 取部分培养上清液于100°C水浴加热10分钟，冷却后按上述步骤进行溶血试验。真正的TDH具有耐热性，加热后仍能溶血（强度可能减弱）。
5. 半定量测定（溶血效价）： 将培养上清液用含3% NaCl的PBS进行系列倍比稀释（如1:2, 1:4, 1:8...）。取不同稀释度的上清液各0.5mL，分别与0.5mL 2%红细胞悬液混合，37°C孵育1-2小时。能引起完全溶血（或50%溶血）的最高稀释倍数即为该菌株的TDH溶血效价。
6. 微孔板法： 原理同试管法，操作在96孔板中进行，更节省试剂，便于高通量检测和光度计读数。

检测标准

副溶血性弧菌TDH检测遵循的主要标准包括：

1. 国家标准：

• 中华人民共和国国家标准 GB 4789.7-2013 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》。该标准明确规定了副溶血性弧菌的神奈川试验（溶血试验）作为检测TDH和判定菌株致病性的推荐方法，详细描述了检测步骤和结果判读要求。

2. 国际参考方法：

• 美国食品药品监督管理局（FDA）的《细菌学分析手册》（Bacteriological Analytical Manual, BAM）中关于副溶血性弧菌的章节。
• 国际标准化组织（ISO）标准 ISO 21872-1:2017 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of *Vibrio* spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic *Vibrio parahaemolyticus*, *Vibrio cholerae* and *Vibrio vulnificus*》。该标准也包含了通过溶血试验进行TDH检测（神奈川现象）作为毒力指示的方法。

3. 结果判读标准：

• 神奈川现象（KP）阳性： 在规定的孵育时间内（通常≤24小时）试验管出现完全溶血（透明鲜红上清），而阴性对照管无溶血。表明该菌株产生TDH，具有潜在致病性。
• 神奈川现象（KP）阴性： 试验管在孵育时间内无溶血或仅轻微溶血（红细胞沉淀，上清澄清或轻微变红）。表明该菌株不产生或极少产生TDH，通常认为无致病性或致病性弱。

这些标准为实验室进行规范、准确和可比的副溶血性弧菌TDH检测提供了权威依据。