干热灭菌生物监测方法

干热灭菌是一种利用高温（通常在160°C至190°C范围内）和干燥空气进行灭菌的方法，主要适用于不耐湿热或易被蒸汽破坏的物品，如玻璃器皿、金属器械、粉末、油剂、凡士林和某些热稳定性强的材料。其灭菌原理是通过热空气的氧化作用破坏微生物的蛋白质、核酸和细胞结构，最终达到杀灭所有微生物（包括细菌芽孢）的目的。干热灭菌过程的验证至关重要，而生物监测是其关键组成部分，用于直接挑战灭菌过程的杀灭微生物能力，提供过程有效性的最直接证据。生物监测利用对干热具有高度抵抗力的标准生物指示剂，模拟灭菌过程对最难杀灭微生物的实际效果。

检测项目

干热灭菌生物监测的核心检测项目是：确定灭菌过程对标准生物指示剂（枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢）的杀灭能力是否达到设计标准和法规要求。具体目标是确认在特定的温度和时间参数下，灭菌后生物指示剂载体上的芽孢是否全部被杀灭，即是否达到无菌保证水平。

检测仪器

进行干热灭菌生物监测需要以下主要仪器和设备：

• 标准生物指示剂： 含有特定数量（通常 ≥ 1.0 × 10⁶ CFU）的枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus atrophaeus, 原称 Bacillus subtilis var. niger）芽孢的载体（如菌片）。该菌种对干热具有公认最强的抵抗力。
• 干热灭菌柜/烘箱： 性能经过验证，能提供均匀、稳定的设定温度和时间的设备。
• 生物指示剂专用载体架/挑战装置： 用于将生物指示剂放置于灭菌柜内预先确定的最难灭菌位置（通常为冷点附近或代表性负载中）。
• 无菌操作工具： 无菌镊子、手套、酒精棉等，用于在无菌条件下取出和处理灭菌后的生物指示剂。
• 微生物培养箱： 能精确控制在30-35°C的培养设备，用于培养生物指示剂。
• 培养基： 胰酪大豆胨液体培养基（TSB）或指定的专用培养基，用于复苏和培养可能存活的芽孢。
• 阳性对照生物指示剂： 与试验指示剂同批次，但不经过灭菌处理，用于验证培养基的促生长能力。
• 阴性对照： 未接种的培养基，用于验证培养基的无菌性。

检测方法

干热灭菌生物监测的标准方法步骤如下：

1. 指示剂布点： 根据验证方案要求，将适量（通常每灭菌周期至少使用一个，但验证时需多点布放）生物指示剂放入专用载体架或挑战装置内，并放置于灭菌柜内预先确认的“冷点”或代表性负载中最难灭菌的位置。
2. 灭菌运行： 按照既定的灭菌程序运行干热灭菌柜，确保温度和时间参数达到设定要求。
3. 指示剂取出与转移： 灭菌程序结束后，待灭菌柜温度降至安全范围（通常≤80°C），在无菌条件下，用无菌工具迅速将生物指示剂从柜内取出。
4. 培养前处理： 根据生物指示剂说明书，可能需要在无菌条件下将菌片（或其他载体）转移至装有培养基的试管中（自含式生物指示剂则直接培养）。
5. 培养： 将接种后的培养基试管或自含式指示剂放入30-35°C的培养箱中培养。培养时间通常为48小时。
6. 阳性与阴性对照： 同时培养阳性对照（同批号未灭菌的指示剂）和阴性对照（未接种培养基）。
7. 结果判读：
   • 观察：在培养结束后（如48小时），肉眼或借助仪器（如比浊仪）观察培养基试管或自含式指示剂的颜色变化（如溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色）。
   • 阳性对照：必须显示生长（如培养基变浑浊或颜色变化），证明培养基和培养条件能支持芽孢生长。
   • 阴性对照：必须无生长（培养基保持澄清或颜色不变），证明培养基无菌。
   • 测试指示剂：如果所有测试的生物指示剂均无生长（无浑浊、无颜色变化），则结果为阴性，表明灭菌过程有效。如果任何一个测试指示剂显示生长（浑浊或颜色变化），则结果为阳性，表明灭菌过程失败。
8. 记录与报告： 详细记录灭菌参数（温度、时间）、指示剂布点位置、批号、培养条件、观察时间和结果判读情况。

检测标准

干热灭菌生物监测需遵循严格的国内外标准和规范，主要包括：

• 《中华人民共和国药典》（ChP）: 通则1421灭菌法对干热灭菌及其生物监测有明确规定。要求使用枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢作为生物指示剂，其存活时间（存活曲线法测定）和杀灭时间（部分阴性法测定）需符合要求。
• ISO 11138-3:2017 Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 3: Biological indicators for moist heat sterilization: 该标准虽主要针对湿热，但其对生物指示剂生产、性能测试（如D值、Z值、存活时间和杀灭时间）和抗力检测的方法原理在干热生物指示剂评估中具有重要参考价值。严格来说，干热生物指示剂应参照类似原则。
• 行业规范与验证指南： 各国药品GMP、医疗器械生产质量管理规范、相关行业指南（如PDA TR #3, ISPE指南等）对灭菌工艺验证（包括生物监测）提出了具体要求。
• 产品说明书： 生物指示剂制造商提供的产品说明书规定了具体的使用、培养和判读方法，是操作的重要依据。

核心要求： 生物监测必须证明，在设定的灭菌条件下，对枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的杀灭能达到不低于6-log的杀灭率（即存活概率≤10⁻⁶），以证明灭菌过程的有效性。这通常通过杀灭时间（T值）或存活曲线/部分阴性法来验证。日常监测则主要看生物指示剂培养结果是否为阴性。

检测机构资质证书

CMA认证

检验检测机构资质认定证书

证书编号：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS认可

实验室认可证书

证书编号：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO认证

质量管理体系认证证书

证书编号：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

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