斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB。

1. HCV 亚复制子基因载体

HCV 亚复制子基因载体由两部分组成：mini-HCV genome 和 HCV-RNA 多聚酶 (NS5B)表达载体。具体构建：克隆小鼠肝脏特异的肝核因子 4a(mHNF4a)序列，并将此序列替换我们前期的 HCV 构件的 CMV 启动子，获得含有 GFP 报告基因的肝脏特异的 mini-HCV genome。克隆斑马鱼的肝型脂肪酸结合蛋白基因的增强子(L-fabpe) 和人肝脂酶启动子序列(hLP)，并与 NS5B 编码序列和报告基因 RFP 序列重组到真核细胞表达载体上，获得肝脏特异的 NS5B 表达载体。这两个基因构件结构图见图 1A。

2. 实验动物

野生型斑马鱼 AB 品系。

3. 造模

取野生型斑马鱼受精卵（1-4 cell 期），通过显微注射将 HCV 亚复制子的两个基因构件混合物(1–5 ng/ml)共注射到受精卵内。正常饲养。待胚胎发育至 4 dpf 幼体，进行后续检测。

4. 模型分析指标

（1） 症状观察

以 WT 斑马鱼为对照，观察斑马鱼幼体表型和生长的变化。

（2） 病毒检测

初筛：荧光显微镜下观察、拍摄幼体内报告基因的表达分布：在肝脏有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共表达的幼体，即为 HCV 亚复制子模型个体。确证：采用斑马鱼整体原位杂交实验、RT-PCR 和 Western blot 检测 HCV 亚复制子的复制和 HCV 特异的复制酶 NS5B 的表达及其肝定位。

（3） 病理诊断

HCV 基因可导致宿主体内病理变化，首先反映在相关基因表达的变化。我们采用 RT-PCR 和 Western blot 方法检测了 HCV 的效应基因如：Solute carrier family 2 (ScarF2)、Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5 (Leugpcr)、Ras-related GTP binding D (Rasgbd)和 Argininosuccinate synthetase 1 (Argsyn)；内质网 应激和 UPR 相关基因如：chop、atf4、atf6 和 bip 基因。