高通量筛选（High-Throughput Screening, HTS）是一种通过自动化技术快速测试数千至数百万种化合物或生物分子活性的方法，广泛应用于 药物发现、功能基因组学、材料开发 等领域。以下是基于 自动化实验平台、数据建模及工业级标准 的系统化技术方案：
一、HTS核心流程与技术要点
| 步骤 |
技术要点 |
关键参数 |
参考标准 |
| 化合物库构建 |
小分子化合物、siRNA/CRISPR文库、天然产物提取物等 |
化合物纯度≥90%，浓度范围（0.1~10μM） |
NIH MLSMR（百万化合物库） |
| 靶点模型设计 |
基于靶点的生化检测（酶活性）、细胞表型检测（报告基因）、类器官/3D细胞模型 |
Z'因子≥0.5（信号窗口与背景噪音比） |
Zhang et al., J. Biomol. Screen. (1999) |
| 自动化加样 |
液体处理工作站（96/384/1536孔板），非接触式分液（声波聚焦、压电喷射） |
分液精度CV≤5%，通量≥10万孔/天 |
Beckman Coulter Biomek i7 |
| 检测方法 |
荧光（FRET/FP）、化学发光（Luciferase）、比色法（MTT）、高内涵成像（HCS） |
信噪比（S/N）≥10，动态范围覆盖3个数量级 |
PerkinElmer EnVision |
| 数据采集 |
多模式读板机（吸光度、荧光、发光）、高分辨率显微镜（活细胞成像） |
数据采集速度≤1秒/孔（384孔板） |
Molecular Devices SpectraMax |
| 数据分析 |
数据标准化（Z-score、B-score）、活性阈值设定（≥3σ）、聚类分析与QSAR建模 |
假阳性率≤5%，假阴性率≤10% |
Genedata Screener |
| 验证与优化 |
剂量-效应曲线（EC50/IC50）、选择性验证（Counter-screening）、ADMET初步预测 |
Hill斜率1~2，R²≥0.95 |
GraphPad Prism |
二、HTS技术对比与选择策略
| 技术类型 |
适用场景 |
优势 |
局限性 |
| 生化筛选 |
酶活性抑制/激活、蛋白-蛋白互作 |
高灵敏度（pmol级检测）、低背景干扰 |
无法模拟细胞环境复杂性 |
| 细胞表型筛选 |
信号通路调控、细胞增殖/凋亡、膜受体激活 |
生理相关性高，可检测多靶点效应 |
通量较低（通常≤50万化合物/次） |
| 高内涵成像 |
亚细胞定位、细胞形态变化、多参数分析 |
空间分辨率高，支持单细胞水平数据 |
数据量大，分析复杂（需AI辅助） |
| 虚拟筛选 |
基于结构的分子对接（AI预测活性化合物） |
成本低，覆盖亿级化合物库 |
准确性依赖靶点结构精度 |
三、核心设备与试剂
| 设备/试剂 |
功能 |
推荐型号/品牌 |
| 液体处理工作站 |
自动化分液与孔板制备 |
Tecan Freedom EVO® 150 |
| 多模式读板机 |
快速检测荧光、发光、吸光信号 |
BMG LABTECH CLARIOstar Plus |
| 高内涵成像系统 |
活细胞动态监测与多参数分析 |
Yokogawa CellVoyager CQ1 |
| 化合物库 |
预选多样性小分子库（FDA批准库、天然产物库） |
ChemDiv Core Library（50万化合物） |
| 检测试剂盒 |
荧光探针（Calcein-AM）、报告基因（Luciferase） |
Promega CellTiter-Glo® |
四、数据标准化与算法模型
- 数据预处理：
- 去除边缘效应（B-score校正）；
- 归一化处理： Z-score=Xraw−μcontrolσcontrolZ-score=σcontrolXraw−μcontrol
- 活性阈值设定：
- 活性化合物：Z-score ≥3 或 ≤-3（双侧筛选）；
- 阈值优化：ROC曲线分析确定临界值。
- QSAR建模：
- 分子描述符计算（MOE、Dragon）；
- 机器学习模型（随机森林、SVM）预测活性。
五、HTS优化策略与挑战
| 挑战 |
解决方案 |
案例 |
| 假阳性率高 |
增加正交验证（SPR验证结合力）、引入多浓度点筛选 |
激酶抑制剂开发中，初筛阳性化合物经SPR验证过滤50%假阳性 |
| 低通量细胞模型 |
微流控芯片（Organ-on-a-chip）、3D细胞球体培养 |
肿瘤类器官模型用于抗肿瘤药物筛选（通量提升5倍） |
| 数据噪声干扰 |
动态背景扣除算法（滑动窗口法）、AI辅助图像分割（U-Net） |
高内涵成像中细胞计数误差降低至≤2% |
| 成本控制 |
混合筛选策略（先虚拟筛选缩小库规模）、迷你aturized反应体系（纳升级液滴） |
1536孔板替代384孔板，试剂消耗减少70% |
六、应用场景与工业案例
- 抗病毒药物开发：
- 靶点：SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）；
- 库规模：20万化合物；
- 结果：发现PF-07321332（Paxlovid®核心成分），EC50=0.07μM。
- 癌症免疫治疗：
- 模型：PD-1/PD-L1互作抑制（FRET检测）；
- 筛选：10万化合物中鉴定出小分子抑制剂（IC50<100nM）。
- 材料筛选：
- 目标：高导电性有机半导体；
- 方法：基于荧光猝灭的快速导电性评估，通量达5000样品/天。
通过系统化HTS流程，可大幅缩短研发周期（传统筛选需数年→HTS仅需数月）。建议结合 AI驱动的虚拟筛选 预筛化合物库，并采用 自动化液体处理+微流控技术 提升通量与精度。对于复杂疾病模型，推荐 类器官与CRISPR筛选联用，以兼顾生理相关性与高通量需求。
